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含多不飽和脂肪酸油脂的功能性已經為消費者所了解和接受,例如含有二十二碳六烯酸(22∶6n-3;DHA)的金槍魚油和含有γ-亞麻酸(18∶3n-6;GLA)的琉璃苣油已經應用于功能性食品和嬰兒食品配料中。最近,含有花生四烯酸(AA)單細胞油也已經用于嬰兒食品配料中。自1991年來,日本已經將二十碳五烯酸乙酯(EtEPA)用于治療動脈硬化和高血脂,應用效果顯著。最近研究表明,DHA、GLA和AA也有望作為醫藥應用,這對此類脂肪酸產品開發與品質提出了更高的要求,它們的純化方法研究已經成為亟需解決的問題。
目前,工業上采用蒸餾和脲包法純化二十碳五烯酸乙酯。據有關報道,采用蒸餾、脲包、高壓液相色譜或銀離子交換色譜技術可以對DHA和GLA進行純化,但此工藝由于其生產成本過高而無法實現工業化生產。因此,更多的研究者轉向酶反應技術的研究。
一般來說,酶對多不飽和脂肪酸的反應活性較弱,利用酶的這個性質,Hoshino等富集了魚油水解后甘油酯相中的多不飽和脂肪酸,包括EPA和DHA。SyedRahmatullah等也報道了通過酶水解琉璃苣油可以獲得富含GLA的油,在此反應中,C1rugosa酶反應效果較好,同樣采用這種酶對含有花生四烯酸的單細胞油進行水解也可獲得富含花生四烯酸的油。目前,日本的富含DHA和GAL油脂的工業化生產就是采用酶選擇性水解實現的,這些產品在功能性食品中得到了廣泛應用。日本學者也曾試圖采用酶選擇性水解非多不飽和脂肪酸酯鍵以達到提高油中多不飽和脂肪酸的含量,但很難使其含量超過70%(W%),這主要是因為酶對多不飽和脂肪酸酯鍵也有一定的水解能力。
后來隨著人們研究的深入,發現酯化過程中酶對脂肪酸的專一性要比在水解過程更明顯,利用這個性質,Hills等首先利用酶催化酯化反應來純化多不飽和脂肪酸,他們首先由月見草油制得游離脂肪酸(FFA),后在己烷溶劑相采用固定化酶,使脂肪酸與丁醇發生酯化反應,他們用此法成功地使GLA在脂肪酸中的含量提高到85%(W%),回收率為64%,如果采用酶技術在非溶劑相中可以實現上述目標,則其工業化前景十分可觀,這也引起了學者對工業化純化多不飽和脂肪酸非溶劑相方法研究的極大興趣。
1選擇性酯化純化多不飽和脂肪酸(PUFA)
工業化選擇性酯化純化多不飽和脂肪酸工藝主要是要求體系具有以下兩個條件:具有高度脂肪酸專一性和高酯化度的酶反應體系;從含有醇、游離脂肪酸和脂肪酸酯混合物中分離出游離脂肪酸的低破壞性方法。
在上述方法中,酶將游離脂肪酸和醇視為反應底物,因此,相對傳統方法來說,即使在水相中以脂肪酸作為底物也可以提高酯化的程度。對于進一步分離過程,研究者多采用分子蒸餾設備作為分離手段,這主要是從運行成本和分離效果考慮,同時這也是有關學者在科學研究中技術平臺概念的具體應用。在醇的選擇上,他們一般選用月桂醇(LauOH)作為底物,主要是因為在長碳鏈醇中其價格最低,另外,它的分子量與脂肪酸和脂肪酸酯也有較大差別。眾多研究結果也證明,游離脂肪酸與月桂醇在20%水相中可達到理想的酯化程度,圖1中給出了采用選擇性酯化純化多不飽和脂肪酸的工藝流程。
此工藝的第一步是含多不飽和脂肪酸油脂的水解,水解方法采用乙醇相堿性條件下水解,工業化過程中此過程需要較大的反應器,而且反應過程中也有多不飽和脂肪酸發生異構化的可能,反應產生廢水含有乙醇,并具有較高的化學需氧量(COD)值,為了進一步分離未反應的游離脂肪酸,需將反應混合物的pH調節至酸性條件,再進行進一步處理。與此相比,如果工業化生產中采用酶法水解,采用分子蒸餾就可分離游離脂肪酸,過程簡單。
此外,采用專一性的酶水解多不飽和脂肪酸油脂也可富集多不飽和脂肪酸,但迄今為止具有多不飽和脂肪酸專一性的酶尚未發現,因此,日本學者采用一種對多不飽和脂肪酸具有一定反應活性的酶進行研究。首先,非選擇性水解含多不飽和脂肪酸油脂,采用分子蒸餾分離游離脂肪酸;第二步采用對多不飽和脂肪酸低選擇性酶催化游離脂肪酸和月桂醇酯化,這樣達到富集多不飽和脂肪酸的目的,后采用分子蒸餾設備分離游離脂肪酸。以下將對酶法純化多不飽和脂肪酸的具體應用情況進行介紹。
1.1金槍魚油中DHA的純化
該研究是以金槍魚油作為原料,采用非溶劑體系的小試研究過程,其游離脂肪酸分離采用正己烷提取,反應過程中采用兩種酶,這兩種酶對于酯化DHA的專一性比對EPA專一性強。該方法的第一步是水解金槍魚油[DHA含量為22%(W%)];第二步,在酶催化下對游離脂肪酸和月桂醇進行選擇性酯化反應,在對各反應條件進行優化后,最終DHA在游離脂肪酸中的含量可提高到75%,然后通過分離游離脂肪酸進行二次反應可使DHA含量提高到91%(W%),DHA回收率為60%(相對金槍魚油中所含DHA量)。
1.2單細胞油脂中花生四烯酸(AA)的純化
該研究是以含AA25%(W%)的單細胞油脂為原料進行研究,非選擇性水解過程采用的酶為Pseu2domonasSP,反應生成的游離脂肪酸采用正己烷進行分離,由于在酯化過程中,AA也有一定程度的酯化,因此該研究采用C1rugosa酶進行酯化,酯化過程AA幾乎沒有發生酯化,一次酯化可使游離脂肪酸中AA的含量提高到51%(W%),由于C.rugosa酶對GLA、二十二碳酸及二十四碳酸的反應活性較弱,因此游離脂肪酸中這些組分的含量也較豐富。
正己烷提取的游離脂肪酸中含有長碳鏈飽和脂肪酸,所以它在反應溫度下(30℃)呈固態,這部分飽和脂肪酸可采用脲包法進行分離,然后再進行選擇性酯化反應以進一步提高AA的含量。經過純化,AA的含量可提高到75%(W%),回收率71%(相對原料中AA量),其中n-6系列多不飽和脂肪酸由30%(W%)提高到89%(W%)。
1.3琉璃苣油中γ-亞麻酸(GLA)分離提純的工業化生產
大量的研究證明,通過與LauOH發生選擇性酯交換可以有效地從金槍魚油和含AA的單細胞油脂中分離和純化DHA和n-6多不飽和脂肪酸,同樣對小規模由琉璃苣油中純化GLA,選擇性酯交換也是一種非常有效的方法。在工業化生產方面,日本學者對大規模工業化純化GLA工藝進行了研究。在純化過程中,他們使用原料油中含有45%(W%)GLA,這種油脂是通過C1rugosa酶選擇性水解琉璃苣油的方法制備的。Pseudomonas和Al2caligens酶對GLA酯具有很強的反應活性。在第一步水解中,使用PseudomonasSP酶進行水解,水解率為92%,后通過分子蒸餾收集油層的游離脂肪酸,在Rdelemar酶催化下游離脂肪酸進行選擇性酯化,GLA的含量提高到8915%(W%),反應體系中含有LauOH(分子量為186),游離脂肪酸(GLA,278)和脂肪酸月桂酯(分子量大于460),從它們的分子量情況可以看出,采用分子蒸餾技術可對其進行分離。
脂肪酸提取部分中含有1815%(W%)脂肪酸月桂酯,但這部分酯對GLA富集影響不大,通過進一步純化,GLA含量可增加至97.3%(W%),經過多步純化過程,GLA相對原料(45%GLA)中GLA回收率為44%。由此得出結論,采用酶反應,蒸餾和脲包法可以有效純化GLA,這種工藝同樣可用于其他多不飽和脂肪酸的純化。
2選擇性醇解純化多不飽和脂肪酸乙酯(EtPUFA)
從多數研究者報道情況看,選擇性酯化純化多不飽和脂肪酸乙酯需經過三步:含多不飽和脂肪酸油脂的非選擇性水解;游離脂肪酸與月桂醇選擇性酯化;多不飽和脂肪酸的乙酯化。
如果脂肪酸乙酯(EtFA)與月桂醇之間能進行選擇性醇解,那么多不飽和脂肪酸酯的富集就可分兩步進行:多不飽和脂肪酸油脂的非選擇性的乙酯化反應;選擇性的醇解。在此思路指導下研究者設計了如下工藝。
在此工藝中,第一步是將含多不飽和脂肪酸油脂轉化為相應的乙酯。此過程可采用堿催化的化學乙醇反應方法,在沙丁魚油生產EPA乙酯的工業化生產中也是采用化學方法,但與化學方法相比,采用溫和條件的酶法則更為理想,因為在堿性條件下進行加熱可能會導致多不飽和脂肪酸的異構化,在反應后通過分子蒸餾將不同碳鏈長度的脂肪酸乙酯加以分離。第二步是富含多不飽和脂肪酸的脂肪酸乙酯混合物的選擇性醇解。如果是以月桂醇為反應底物則最終的反應混合物中含有月桂醇(分子量為186),脂肪酸乙酯(多不飽和脂肪酸乙酯的分子量為328)和脂肪酸月桂酯(分子量為422以上),這些組分采用分子蒸餾就可進行有效分離,通過此工藝可以有效對多不飽和脂肪酸乙酯進行純化。
2.1金槍魚油制備高純度多不飽和脂肪酸乙酯(EtPUFA)
據報道,在固定化酶催化下,甘三酯可與短碳鏈醇發生反應,但此反應體系要求有機溶劑體系(正己烷),否則固定化酶不能多次使用,基于工業化生產考慮,日本學者提出了新的體系:非有機溶劑相以防爆炸隱患;固定化酶的反應活性可維持相當長時間。
目前美國、日本學者對酶法將廢棄食用油轉化為乙酯(生物燃料)進行過大量的研究,在此過程中他們發現,當固定化酶接觸到甲醇時就會失去活性,甲醇在該反應混合物中是不溶解的,但他們通過逐漸加入甲醇可有效地將廢油轉化為生物燃料,他們將此發現用于乙醇與金槍魚油反應體系。第一步反應是加入金槍魚油中總脂肪酸摩爾數三分之一的乙醇,使用的酶為C.antarctica,在反應體系中乙醇全部反應后分別加入另外三分之二摩爾數的乙醇(每個反應周期為48h),反應結束后96%甘三酯轉化為脂肪酸乙酯,而酶在使用100d后其活性幾乎沒有發生變化。
將脂肪酸乙酯進行分子蒸餾分離,此過程可使DHA乙酯由原來的23.7%(W%)提高到57.2%(W%),DHA乙酯的損失很少,在非水相體系中,在酶催化下脂肪酸乙酯和月桂醇之間的醇解反應可以順利進行。日本學者報道了用固定化酶與月桂醇選擇性醇解的有關情況,增加月桂醇的量對于長時間的醇解反應具有促進效果,對于脂肪酸的選擇性也有所改善,但過量的月桂醇會降低反應產物中乙酯的量,同時也需要更大的反應器,由此他們將月桂醇定量為脂肪酸乙酯摩爾數的7倍,在此條件下,醇解可達50%左右,DHA乙酯的含量也提高到90%(W%),如果醇解反應是在固定化床生物反應器上進行的,酶的使用超過200d。
月桂醇、脂肪酸乙酯和脂肪酸月桂酯可通過分子蒸餾進行分離,脂肪酸乙酯中脂肪酸月桂酯的含量很低,采用脲包法可除去,DHA乙酯的最終得率為52%。
2.2共軛亞油酸(CLA)異構體的分離
CLA是順式或反式結構中有共軛雙鍵的C18脂肪酸。工業上,CLA是紅花籽油或葵花籽油在丙二醇或乙二醇中堿催化下共軛化產生,制備的產品中含有幾乎等量的順9,反11(c9,t11)和反10,順12(t10,c12)異構體,此CLA混合物具有多種生理功能。實驗證明,CLA具有預防癌癥,減少人體脂肪,預防粥樣動脈硬化和增強免疫功能。天然CLA存在于肉中和反芻動物的奶中,主要的異構體為c9,t11-CLA,其含量達CLA的75%,盡管人們在多數生理功能研究中使用CLA混合物,根據最近報道,t10,c12-CLA參加降脂過程,c9,t11-CLA具有抗癌作用,激發了學者對于CLA分離研究的興趣。
最近,有關學者報道采用酶法可有效分離CLA異構體,Haas等[21]研究表明,G1candidum酶對c9,t11-CLA的選擇性遠大于對t10,c12-CLA的選擇性,他們先在有機溶劑相中將CLA異構體與甲醇進行酯化,后成功地從反應的初始產物中分離了c9,t11-CLA甲酯,與此同時,Mcmeil等也報道了采用酶可反應分離c9,t11-和t10,c12-異構體。他們將CLA異構體與月桂醇進行酯化反應,并對反應產物進行分離,一部分為游離脂肪酸(富含t10,c12-CLA),另一部分為脂肪酸月桂酯(富含c9,t11-CLA),同系結構的酶具有相似的性質,G.candidum與C.rugosa屬于同一系酶,因此,Mcneill等選用C.rugosa酶作為催化劑,通過兩步反應成功地純化了c9,t11-CLA(95.6%)和t10,c12-CLA(94.9%)。
3結束語
酶技術成為現代快速發展技術之一,它在油脂中也有廣泛應用和研究,但將該技術用于油脂相關功能性物質的純化尚不多見。通過國外相關研究表明,酶技術在純化多不飽和脂肪酸,分離CLA異構體,純化維生素E和植物甾醇方面具有重要的實用價值。另外,在眾多酶技術研究中,在最后產品分離時大多采用分子蒸餾,而不采用溶劑分離技術,這也是基于技術平臺概念的具體應用,這部分研究對于酶技術的推廣和應用也具有重要意義。
